ĐẶT VẤN ĐỀ
      Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới (WHO) có khoảng 2 tỉ người nhiễm HBV trên toàn cầu, trong đó hàng năm có khoảng 350 triệu người mắc virus viêm gan B cấp và mạn tính. Tỉ lệ tử vong trong giai đoạn cấp tính là 1%, biến chứng của viêm gan B cấp là viêm gan mạn, xơ gan, xơ gan mất bù và ung thư gan nguyên phát, dẫn đến tử vong cho khoảng 1 triệu người mỗi năm. Tại Việt Nam có khoảng 15% - 20% người nhiễm HBV, trong đó có  khoảng 80- 92% bệnh nhân xơ gan và ung thư gan nguyên phát có nhiễm HBV. 
      HBV là virus có mang cấu trúc gene di truyền dị thể, có đến 8 genotype từ genotype A đến genotype H ngoài ra còn có 4 type phụ (subtype) là adw, adr, ayw và ayr được gặp ở virus này. Đặc biệt với cấu trúc gene này chứa đựng một nguy cơ tiềm tàng rất lớn về khả năng xảy ra các đột biến, mà một trong những đột biến quan trọng là đột biến kháng các thuốc chống virus trong số đó thường gặp nhất là đột biến YMDD kháng Lavumidine của virus.
   Kỹ thuật realtime PCR (Polymerase chain reaction) là một trong những phương pháp hữu hiệu để định genotype và phát hiện các đột biến kháng thuốc Lamivudin của virus HBV. Vì thế chúng tôi tiến hành đề tài : “Ứng dụng kỹ thuật Realtime PCR để xác định genotype và đột biến kháng Lamivudine của virus viêm gan B trên bệnh nhân đang điều trị tại bệnh viện đa khoa tỉnh Bình Định”, với 2 mục tiêu:
- Xác định thành phần genotype của virus VGB trên bệnh nhân đang điều trị tại bệnh viện đa khoa Bình Định.
- Xác định tỷ lệ đột biến kháng Lamivudine của virus VGB trên bệnh nhân đang điều trị tại bệnh viện đa khoa Bình Định.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1. Đối tượng nghiên cứu:

• Những bệnh nhân viêm gan B đến khám và điều trị tại khoa Truyền nhiễm có kết quả định lượng virus viêm gan B bằng kỹ thuật realtime PCR  với số lượng ≥ 10⁴ copies/ml.

 2.Vật liệu nghiên cứu:

• Phiếu yêu cầu xét nghiệm được điền đầy đủ các thông tin hành chính.
• Lấy 3ml máu của bệnh nhân cho vào ống nghiệm chuyên dụng.
• Dụng cụ, phương tiện lấy mẫu, hóa chất tách chiết DNA, hóa chất cho phản ứng real-time PCR, máy real-time PCR, phần mềm phân tích kết quả QrPCR.

 3. Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu ngang mô tả

• Thời gian nghiên cứu từ tháng 06 năm 2009 đến tháng 06 năm 2010. 

• Những mẫu huyết thanh có kết quả định lượng virus viêm gan B với số lượng ≥ 10⁴ copies/ml được tiến hành xác định genotype và đột biến kháng Lamivudine của virus HBV bằng kỹ thuật real-time PCR.

4. Xử lý dữ liệu:
Dữ liệu được nhập và xử lý trên phần mềm SPSS 15.0.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Đặc điểm dân số nghiên cứu:
Bảng 1. Một số đặc điểm của dân số nghiên cứu.

Đặc tính		Tần số	Tỷ lệ %
Giới	Nam	89	59,3
	Nữ	61	40,7
Nhóm tuổi	<16	18	12
	16-30	42	28
	31-60	80	53,3
	>60	10	6,7
	Tuổi trung bình	35,35 ± 14,55 (nhỏ nhất:10; lớn nhất:74)
Nghề nghiệp	Làm nông	67	46,7
	Học sinh, sinh viên	28	18,7
	CNVC	41	27,3
	Khác	14	9,3
Địa dư	Nông thôn	92	61,3
	Thành phố	41	27,3
	Trung du, Miền núi	17	11,4

Trong nghiên cứu này Nam chiếm 59,3%, Nữ 40,7%; nhóm tuổi 31-60 chiếm 53,3%; tuổi trung bình 35,35 ± 14,55; Nghề nghiệp chủ yếu là làm nông 46,7% kế đến là CNVC 27,3%; Tỷ lệ người ở nông thôn gặp cao nhất 61,3%.
3.2. Thành phần genotype của virus viêm gan B trong nhóm nghiên cứu
Bảng 2. Thành phần genotype của HBV trong nhóm nghiên cứu.

Loại Genotype	Tần số	Tỷ lệ %
Genotype B	113	75,3
Genotype C	36	24
Genotype A	1	0,7

Tỷ lệ Genotype B chiếm cao nhất 75,3%, tiếp đến genortype C là 24%. Chúng tôi có gặp 1 trường hợp Genotype A chiếm 0,7%.
Theo nghiên cứu của Hoàng Tiến Tuyên tại Bệnh viện 108 thì genotype B là 46% và genotype C là 51,6%[5]. Kết quả NC của Phạm Thị Lệ Hoa thì genotype B là 71,9% và genotype C là 28,1%[2]. Theo Trung tâm gan mật Sài Gòn thì genotype B là 68,2%; genotype C là 17,1% và genotype A là 0,9%[7].
3.3. Tỷ lệ virus có đột biến kháng thuốc Lamivudin
                   Biểu đồ 1. Tỷ lệ virus có đột biến kháng thuốc
Tỷ lệ đột biến kháng Lamivudin trong nghiên cứu chúng tôi là cao 54,6%, so với tác giả Phạm Thị Lệ Hoa thì tỷ lệ này là 34,9%[2] và của Hồ Tấn Đạt thì tỷ lệ này chỉ là 27,8%[3]
3.4. Đặc tính kháng thuốc
Bảng 3. Tỷ lệ đột biến kháng thuốc Lamivudin tại các vị trí.

Loại đột biến	Tần số	Tỷ lệ %
M204V/I	82	54,6
M204V	61	40,6
M204I	21	14
L180M	59	39,7

Đột biến M204V chiếm 40,6% là đột biến chủ yếu trong đột biến M204V/I; Đột biến M204I chiếm 14% còn đột biến L180M chiếm 39,7%.
3.5. Kiểu phối hợp đột biến kháng thuốc
Bảng 4. Các kiểu phối hợp vị trí đột biến kháng thuốc Lamivudin

Kiểu phối hợp đột biến	Tần số	Tỷ lệ %
M204V	14	17,1
M204I	9	10,9
M204V + L180M	47	57,3
M204I + L180M	12	14,7

Đột biến đơn tại vị trí 204 chúng tôi gặp M204V 17,1%; M204I 10,9%. Đột biến đồng thời 2 vị trí 204 và 180 thì kiểu phối hợp M204V + L180M 57,3%; còn kiểu phối hợp M204I + L180M là 14,7%.
3.6. Đột biến kháng thuốc Lamivudin theo loại genotype
Bảng 5. Đột biến kháng thuốc Lamivudin theo loại genotype

Loại genotype	Tần số	Tỷ lệ %
Genotype B	68	60,2
Genotype C	14	38,9
Genotype A	0	0

Tỷ lệ có đột biến kháng thuốc Lamivudin của genotype B là 60,2% cao hơn tỷ lệ đột biến kháng thuốc của genotype C là 38,9%.
Theo Phạm Thị Lệ Hoa thì Genotype B có tỷ lệ kháng thuốc nhiều hơn genotype C (67,6% so với 34,1%)[2].
3.7. Liên quan giữa Genotype và kiểu phối hợp đột biến kháng thuốc Lamivudin
Bảng 6. Liên quan giữa Genotype và kiểu phối hợp đột biến kháng thuốc Lamivudin

	Genotype B		Genotype C
	Tần số	Tỷ lệ %	Tần số	Tỷ lệ %
Đột biến 1 vị trí	18		5
		78,3		21,7	P < 0,05
Đột biến 2 vị trí	50		9
		84,7		15,3

Tỷ lệ đột biến kháng thuốc tại 1 vị trí (204) và đột biến kháng thuốc tại 2 vị trí (204 và 180) của genotype B đều cao hơn so với genotype C ( p < 0,05).
3.8. Liên quan giữa tuổi trung bình với đột biến kháng thuốc Lamivudin
Bảng 7. Liên quan giữa tuổi trung bình với đột biến kháng thuốc Lamivudin

	Tuổi trung bình	Độ lệch chuẩn
Có đột biến kháng Lamivudin	35,29	14,56	P > 0,05
Không có đột biến kháng Lamivudin	36,09	15,02

Không có sự khác biệt giữa tuổi trung bình của người bệnh và đột biến kháng thuốc Lamivudin trong nhóm nghiên cứu.
3.9. Liên quan giữa giới tính với đột biến kháng thuốc Lamivudin
Bảng 8. Liên quan giữa giới tính với đột biến kháng thuốc Lamivudin

Giới	Đột biến kháng thuốc Lamivudin		Tổng số
	Có	Không
Nam	85 (95,5%)	4 (4,5%)	89 (100%)
Nữ	54 (88,5%)	7 (11,5%)	61 (100%)
χ2 = 2,60                 p > 0,05                      OR =2,7

Không có sự khác biệt giữa giới tính và đột biến kháng thuốc Lamivudin của virus viêm gan B trong nhóm nghiên cứu.
KẾT LUẬN
Qua khảo sát về genotype và đột biến kháng thuốc Lamivudin của 150 chủng virus viêm gan B trên những bệnh nhân viêm gan được khám và điều trị tại bệnh viện đa Khoa tỉnh Bình Định, chúng tôi nhận thấy:

• Tỷ lệ Genotype B chiếm cao nhất 75,3%, tiếp đến genortype C là 24% và  Genotype A chiếm 0,7%.
• Tỷ lệ virus có đột biến kháng Lamivudin là 54,6%.
• Đột biến M204V là đột biến chủ yếu trong đột biến M204V/I chiếm 40,6%; Đột biến M204I chiếm 14% còn đột biến L180M chiếm 39,7%.
• Tỷ lệ có đột biến kháng thuốc Lamivudin của genotype B là 60,2% và của genotype C là 38,9%.
• Tỷ lệ đột biến kháng thuốc tại 1 vị trí (204) và đột biến kháng thuốc tại 2 vị trí (204 và 180) của genotype B đều cao hơn so với genotype C ( p < 0,05).
• Không có sự khác biệt giữa tuổi trung bình và giới tính của người bệnh với đột biến kháng thuốc Lamivudin trong nhóm nghiên cứu.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Đông Thị Hoài An, Cao Minh Nga (2003), “Kỹ thuật định tip gen siêu vi viêm gan B bằng Multiplex PCR trên bệnh nhân nhiễm siêu vi viêm gan B mạn”, Từ khoa học sinh học phân tử đến cuộc sống và chăm sóc sức khỏe, tr. 17-25
2. Phạm Thị Lệ Hoa, Nguyễn Hữu Chí, Cao Ngọc Nga, Nguyễn Thị Cẩm Hường, Phạm Hùng Vân (2008)“ Đặc tính kháng Lamivudin trên bệnh nhân viêm gan B mạn không đáp ứng với điều trị tại BV. Bệnh Nhiệt Đới” Y học TPHCM- tập 12- phụ bản số 1- năm 2008.
3. Hồ Tấn Đạt, Phạm Thị Thu Thủy, Nguyễn Bảo Toàn (2006) “Xác định kiểu gen và các đột biến kháng thuốc của siêu vi viêm gan Bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi.” Y Học Việt Nam 329( số đặc biệt tháng 12/2006)
4. Bùi Hữu Hoàng (2004) “Đặc điểm của dấu ấn huyết thanh và kiểu gen của virus viêm gan B trên bệnh nhân xơ gan và ung thư gan” Luận văn tốt nghiệp.
5. Hoàng Tiến Tuyên, Nguyễn Văn Mùi, Trịnh Thị Hòa (2009) “Nghiên cứu mối liên quan giữa kiểu gen với markers ở bệnh nhân viêm gan siêu vi B mạn tính” Tạp chí Y-Dược học quân sự-tập 34- số đặc biệt 2009.
6. Nguyễn Chí Vinh, Hồ Quỳnh Thùy Dương, Phạm Hoàng Phiệt (2007) “Nghiên cứu triển khai kỹ thuật PCR-RFLP để chẩn đoán đột biến kháng Lamivudin ở virus viêm gan B”. Tạp chí gan mật số 1-2007.
7. www. Saigonliver.com/home.php?npage=16& (2009) “Sụ liên quan của kiểu gen virus viêm gan B với các dạng lâm sàng của viêm gan B”.
8. Anna S. F. Lok, Brian J. Mcmahon (2007)“Chronic Hepatitis B Update of recommendations” AASLD practice, Guideline
9. Kobayashi M, Suzuki F, (2006) “Response to long-term lamivudine treatment in patients infected with hepatitis B virus genotypes A, B, and C” J Med Virol 78(10): 12 76-1283

10. Kumar M.,  Satapathy S.,  Monga R. (2007) “A randomized controlled trial of lamivudine to treat acute hepatitis B” Hepatology 45(1) p: 97-101

11. Norio A., Hiromitsu K. (2005) “Influence of hepatitis B virus genotype on the response to antiviral therapies”Journal of antimiocrobiol. chemotherapy 55 p: 139-142

12. Stephen locarnini, Tim Shaw (2004) “Antiviral drug resistance in